10個月發(fā)證：一株耐酸耐堿快速脫氮的好氧反硝化細菌、菌劑及其應用（廣州大學）

一、發(fā)明專利案件基本信息

技術領域：微生物，水產(chǎn)養(yǎng)殖，污水處理，硝化和反硝化

專利號：ZL 202210064085.4

專利名稱：一株耐酸耐堿快速脫氮的好氧反硝化細菌、菌劑及其應用

專利申請日：2022-01-20

專利授權日：2022-12-16

專利申請人：廣州大學

發(fā)明人： 舒琥; 林浩澎; 馬永浩; 孫慧明; 陳瓊華; 羅聘婷

專利代理機構：廣州高炬知識產(chǎn)權代理有限公司

專利代理師：孫明科

二、發(fā)明專利申請文件信息

申請文件：20頁，0.98萬字，附圖11

授權權利要求：4，其中獨立權利要求：3

權項結構樹：

三、發(fā)明內(nèi)容摘要：

本發(fā)明屬于微生物脫氮技術領域，公開了一株耐酸耐堿快速脫氮的好氧反硝化細菌、菌劑及其應用，所述好氧反硝化細菌為假單胞菌屬變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）菌株ZY-3，于2022年1月4日保藏在廣東省微生物菌株保藏中心（GDMCC），保藏編號為GDMCC No：62181；該菌株及菌劑同時具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力，生長速度快、降氮速率高，可分別利用NH+ 4-N、NO- 3-N和NO- 2-N作為唯一無機氮源進行好氧硝化和反硝化脫氮。該菌株及菌劑能夠在pH值5.5-10.5的水體環(huán)境中發(fā)揮硝化-反硝化作用，同時具有良好的生物安全性。

四、發(fā)明摘要附圖：

五、獨立權利要求3條：

1. 一株耐酸耐堿快速脫氮的好氧反硝化細菌，其特征在于，所述好氧反硝化細菌菌株為假單胞菌屬變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）ZY-3，于2022年1月4日保藏在廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），保藏地址為廣東省廣州市越秀區(qū)先烈中路100號大院實驗大樓5樓，保藏編號為GDMCC No：62181。

2 .一種生物脫氮菌劑，其特征在于，其包括權利要求1所述的好氧反硝化細菌菌株ZY?3。

3 .根據(jù)權利要求1所述的一株耐酸耐堿快速脫氮的好氧反硝化細菌或權利要求2所述的生物脫氮菌劑在含氮污水脫氮處理中的應用，分別利用NH+ 4-N、NO- 3-N和NO- 2-N作為唯一無機氮源進行好氧硝化和反硝化脫氮。

六、專利權人與發(fā)明人團隊簡介

本發(fā)明由廣州大學生命科學學院教學與科研團隊完成, 第一發(fā)明人舒琥教授，博士，博士生導師；廣州大學華南生物多樣性研究所副所長，廣州大學華南生物多樣性保護與利用重點實驗室副主任，廣州大學生物學一級學科碩士點方向帶頭人。廣東水產(chǎn)學會常務理事和動物學會理事，廣東省農(nóng)村科技特派員及企業(yè)特派員，廣東省市科技項目評審專家、廣東省科技興海重大專項項目評審專家。

科研方面：主要從事經(jīng)濟魚類繁育與綠色健康養(yǎng)殖，魚類生理與分子生物學等方面的研究。負責廣東省生物種質(zhì)資源庫——《廣東大亞灣重要海洋經(jīng)濟動物種質(zhì)資源庫建設》平臺，主持或參加國家及省部級科研項目30余項，在《Bioresource technology 》、《fish & shellfish immunology》等期刊發(fā)表學術論文100多篇（其中SCI收錄25篇），獲得國家發(fā)明專利授權7件，實用新型13件，先后獲湖南省教委科技進步二等獎1項，廣東省科學技術獎三等獎1項，第四屆中國水產(chǎn)學會范蠡科學技術獎一等獎1項，2019年神農(nóng)中華農(nóng)業(yè)科技三等獎1項。

教學方面：主講本科課程《動物學》、《普通生物學》，研究生課程《魚類分子育種》等；負責國家教育部、廣東省高校生命科學校企協(xié)同育人基地群,廣東省高校大學生重點校外實習基地及廣州大學生物技術校企協(xié)同育人班的教學實踐;主持國家教育部新農(nóng)科項目1項，廣東省質(zhì)量工程等教改課題10余項，獲廣東省教學成果二等獎1項、市校級教學成果獎多項及廣東省“南粵優(yōu)秀教師”和廣州大學優(yōu)秀教師稱號，獲廣州大學教學優(yōu)秀二等獎3項;指導學生獲全國大學生生命科學競賽二等獎1項、廣東省一等獎和三等獎各1項，“挑戰(zhàn)杯”廣東省大學生課外科技作品論文一等獎2項，三等獎3項，并獲“廣州大學大學生課外學術活動優(yōu)秀指導教師”稱號。主編和合編教材7部。

七、本發(fā)明主要的有益效果：

（1）本發(fā)明所述變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）菌株ZY-3及其菌劑，同時具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力，可以利用多種有機碳源，并具有較好的水體有機碳去除能力；能夠克服不同需氧量引起的硝化反硝化不相容問題，使硝化和反硝化作用在同一好氧反應器內(nèi)同步進行，在完全好氧的條件下，該菌株及菌劑可分別利用NH+ 4-N、NO- 3-N和NO- 2-N作為唯一無機氮源進行好氧硝化和反硝化脫氮；其去除效率最高分別可達93.56%、100%和92.22%。

（2）本發(fā)明所述變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）菌株ZY-3及其菌劑，能夠適應酸性（pH≥5.5）和堿性（pH≤10.5）水體環(huán)境，發(fā)揮硝化-反硝化作用，實現(xiàn)酸、堿水體的微生物脫氮；將該菌株應用于鹽堿地、含氮工業(yè)廢水的處理，有利于簡化廢水處理工藝，提高處理效率，符合環(huán)境友好要求，具有良好的經(jīng)濟及環(huán)保效益。

（3）本發(fā)明所述變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）菌株ZY-3及其菌劑，對水產(chǎn)養(yǎng)殖對象無不良影響，具有較高的水生生物生物安全性；并對硫酸慶大霉素、鹽酸四環(huán)素、頭孢他啶、哌拉西林-他唑巴坦、妥布霉素等多種臨床常用抗生素表現(xiàn)為敏感，具有較高的生態(tài)安全性，因此可應用于大多數(shù)的含氮水產(chǎn)養(yǎng)殖水體處理領域，有利于減少設備占地面積和建設成本，提高處理效率，還能大幅減少水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的周期性換水，具有良好的經(jīng)濟及環(huán)保效益，應用前景廣闊。

八、本案專利代理師經(jīng)驗分享：

中國是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大國，當前，我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖模式為高密度、集約化，此模式操作方便、產(chǎn)量高、效益好，但易造成養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)積累，對環(huán)境、人類及養(yǎng)殖動物均有一定的危害，不利于長遠的發(fā)展。目前，治理含氮養(yǎng)殖尾水的有效脫氮方法主要包括物理處理法、化學處理法、生物處理法和循環(huán)水養(yǎng)殖技術等，其中，生物處理法中的好氧反硝化細菌制劑作為一種新型水體降氮方法，具有安全性高、效果好、成本低的優(yōu)點，已成為目前國內(nèi)外的研究熱點。

目前國內(nèi)外研究的好氧反硝化細菌，普遍具有強大的降氮性能，且存在菌株同時具備消除氨氮、硝態(tài)氮與亞硝態(tài)氮的能力。但值得注意的是，同時具備消除氨氮、硝態(tài)氮與亞硝態(tài)氮能力的菌株仍占少數(shù)，且一般都需要經(jīng)過較長時間的耗氧培養(yǎng)才能顯示出較強的脫氮能力。其中最短培養(yǎng)時間為24h，但其實驗中所使用的模擬廢水氮的初始濃度并不高，可知高濃度氮對好氧反硝化菌株的脫氮具有抑制作用，細菌難以適應和處理高濃度含氮廢水。其次，目前國內(nèi)外研究的好氧反硝化細菌對pH條件十分敏感，一般都需要在中性條件或偏堿性下才能生長并發(fā)揮降氮作用。對于具有高酸堿度的工業(yè)廢水和養(yǎng)殖尾水，大多數(shù)反硝化細菌無法正常進行生長增殖，發(fā)揮降氮作用。因此，進一步地研究和篩選具有高效降高濃度氮能力與具有廣泛pH適應范圍的好氧反硝化菌株，對于進行不同的污水處理有顯著幫助，并且有利于改善脫氮工藝，開發(fā)微生物降氮制劑產(chǎn)品。但是，現(xiàn)有該菌株對硝態(tài)氮的去除速度較慢，在最佳條件下培養(yǎng)，其在0~24h為遲緩期，24h后才進入對數(shù)生長期，不能滿足實際水產(chǎn)養(yǎng)殖的水處理應用需求。

應用在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中微生物菌株對養(yǎng)殖對象不能有致病性，應用前必須通過生物安全性評估。然而人們對好氧反硝化細菌在水生系統(tǒng)中的有益作用機制研究甚少，目前在對菌株的研究和向?qū)嶋H應用過渡的過程中，常常缺少對微生物菌株的生物安全性試驗與耐藥性試驗，這可能忽視了某些微生物菌劑的潛在有害作用，因此人們?nèi)孕枰蛛x純化得到更多高效、穩(wěn)定、安全的好氧反硝化菌株進行進一步的生物安全性與生態(tài)風險評估。

因此，本發(fā)明人團隊，針對現(xiàn)有技術目前還缺乏具備高效降氮能力、具有較高生物安全性、能同時處理高酸高堿含氮污水的好氧反硝化菌株，難以使用生物方法處理高酸堿性的工業(yè)、養(yǎng)殖廢水，而提供一株耐酸耐堿快速脫氮的好氧反硝化細菌、菌劑及其應用，并且使其具備優(yōu)異的生物學性能，能滿足使用生物方法處理高酸堿性的工業(yè)、養(yǎng)殖廢水的多方面的需求。

本發(fā)明提供的一株耐酸耐堿快速脫氮的好氧反硝化細菌，為假單胞菌屬變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida ）菌株ZY-3，保藏編號為GDMCC No：62181。本發(fā)明提供的變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）菌株ZY-3是通過富集、梯度稀釋、選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)并通過脫氮能力定性篩選等方法篩選得到。

本發(fā)明該提供了一種包括有所述變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）ZY-3的生物脫氮菌劑，其為包含該ZY-3菌株的菌液。將所述好氧反硝化細菌菌株ZY-3及菌劑，應用于含氮污水的生物脫氮處理，分別利用NH+ 4-N、NO- 3-N和NO- 2-N作為唯一無機氮源進行好氧硝化和反硝化脫氮。

本發(fā)明所述變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）菌株ZY-3及其菌劑，同時具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化功能；在完全好氧的條件下，該菌株能夠利用NH+ 4-N、NO- 3-N和NO- 2-N作為唯一無機氮源進行好氧硝化和反硝化脫氮，且去除速率快，能夠在pH=5.5~10.5的水體中生長并發(fā)揮異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用，對pH的適應范圍廣。

本專利涉及多個學科和技術領域，包括微生物學、水產(chǎn)養(yǎng)殖、污水處理、硝化與反硝化反應原理等，對專利代理師的跨領域的專業(yè)能力、綜合水平，對微生物、水產(chǎn)、水處理等領域的經(jīng)驗要求較高。我公司派出專利代理師孫明科與研發(fā)團隊對接，反復多次與研發(fā)團隊深入交流，共同分析技術問題和發(fā)明要點，在深度檢索和多次撰寫修改的基礎上，完成了本項發(fā)明專利的申請文件。本案專利代理師通過與舒琥教授科研團隊密切溝通，認真聽取發(fā)明人的構思和技術方案，并且進行了深入的技術檢索、對比和技術挖掘，準確定位技術問題和核心發(fā)明點，從而得到了本發(fā)明呈現(xiàn)的較為完善的技術方案，并且順利獲得授權。申請權利要求與授權權利要求改動較小，核心發(fā)明點均得到了應有的保護。

   本專利是專利代理師與發(fā)明人團隊深入交流、科學布局、密切合作完成的跨領域高質(zhì)量專利申請案件，雙方多次、反復討論、修改了多稿才最終定稿，發(fā)明人科研團隊及代理師對本發(fā)明均付出了辛苦的勞動。

本發(fā)明專利作為微生物、水產(chǎn)養(yǎng)殖領域的高質(zhì)量的發(fā)明專利，與申請人布局的其他發(fā)明專利相互配合，對微生物、菌劑、水處理方法等進行了合理分層、遞進式的保護，采用快速的申請和審查答復，大幅縮短了審查時間。本發(fā)明專利快速獲得授權后，有利于該申請人對該專利技術成果進行轉(zhuǎn)化、實施，盡早投入使用，產(chǎn)生更好的社會和經(jīng)濟效益。